La costruzione fu iniziata nel 1560 è realizzata adottando l'ordine dorico, secondo il Vasari, "più sicuro e più fermo degl'altri, [...] sempre piaciuto molto al signor duca Cosimo" nel 1565 presentava già completati i cosiddetti Uffizi Lunghi e il tratto che si affacciava sull'Arno.

Il palazzo degli Uffizi è composta da due corpi di fabbrica longitudinali principali, collegati verso sud da un lato più breve del tutto analogo, dando origine così ad un complesso a "U", che abbraccia un piazzale e sfonda prospettivamente verso piazza della Signoria, con una perfetta inquadratura di Palazzo Vecchio e della sua torre.

I tre corpi di fabbrica presentano lo stesso modulo: a pianterreno un loggiato architravato coperto con volta a botte, costituito da campate delimitate da pilastri con nicchie e suddivise in tre intercolumni da due colonne interposte tra i pilastri; a tale modulo corrispondono tre aperture nel soprastante finto mezzanino che servono ad illumunare il portico e tre finestre al primo piano che presentato l'alternanza tra timpano triangolare e timpano curvilineo e sono comprese tra lesene; infine all'ultimo piano un loggiato riprendeva il modulo tripartito ed avrebbe in seguito ospitato l'originaria "Galleria" degli Uffizi.

Al pian terreno corre un porticato per tutta la lunghezza dei lati ovest e sud, e per il lato est fino a via Lambertesca; sopraelevato su un podio di alcuni gradini, il portico è costituito da colonne doriche e pilastri con le nicchie per statue che sorreggono un architrave, ma è coperto da lunghe volte a botte, decorate da cornici rettangolari a rilievo, che sono collegate tra loro da fasce disegnanti un motivo geometrico spezzato.

Il portico architravato rappresenta una grande novità nella storia dell'architettura, in quanto i portici medievali, e poi quelli rinascimentali, erano costituiti da una serie di archi e mai di architravi, sia a Firenze (come per esempio il portico dello Spedale degli Innocenti), sia altrove.

Ai piani superiori si ripete un modulo di tre riquadri, tre finestre con balconcini e timpani ripsettivamente triangolare, circolare e di nuovo triangolare (primo piano) e tre aperture sulla loggetta superiore (oggi la galleria del secondo piano), divise da due colonnine. I piani sono divisi da maestose cornici marcapiano. Gli elementi architettonici sono sottolineati dall'uso della pietra serena (in particolare di quella estratta dalla valle della Mensola), che risalta sull'intonaco bianco, secondo lo stile più tipicamente fiorentino iniziato da Brunelleschi.

Il lato breve è caratterizzato da un grande arco componente una serliana che inquadra scenograficamente l'affaccio sull'Arno, sormontata da una loggia, aperta sia sul piazzale antistante che sull'Arno, come vero e proprio fondale teatrale, ispirato alle coeve realizzazioni scenografiche. Al primo piano le grandi finestre hanno un scoronamento ad arco e davanti a quella centrale, la più ampia, corrispondente internamente al Verone, si trovano tre statue: Cosimo I in piedi di Giambologna (1585), affiancato dalle personificazioni sdraiate dell'Equità e del Rigore, entrambe di Vincenzo Danti (1566). Nelle nicchie dei pilastri del loggiato fu progettato di inserire una serie di statue di fiorentini famosi, la realizzazione si iniziò solo a partire dal 1835.

Molto originale è il portale ("porta delle Suppliche") costruito da Bernardo Buontalenti su via Lambertesca: è coronato da timpano spezzato, ma per maggiore originalità Buontalenti invertì le due metà, ottenendo una sorta di timpano "ad ali", che ricorda gli spunti animalistici e organici della sua architettura.